(Progetti di Ricerca Corrente 2024) Negli ultimi anni sono state sviluppate nuove tecniche di miglioramento genetico delle piante, incluse le tecniche di mutagenesi mirata genericamente chiamate "editing del genoma" (GE). Il sistema CRISPR/Cas9 è attualmente il più promettente per semplicità d’uso e per specificità. Nel sistema CRISPR/Cas9, infatti, il riconoscimento della sequenza di DNA da modificare è operata non da proteine, ma da una sequenza di RNA. Ad oggi, i soli sistemi analitici in grado di caratterizzare adeguatamente i prodotti di GE sono basati sul sequenziamento del DNA dell’organismo trasformato, operazione non proponibile in routine diagnostica per i costi ed i tempi di esecuzione elevati.

Questo progetto ha lo scopo di completare ed approfondire il lavoro svolto per la RC LT 07/20. In tale progetto è stata utilizzata la tecnica dell’High Resolution Melting (HRM), una metodica post qPCR, condotta in presenza di un fluoroforo che, intercalandosi nella doppia elica del DNA emette fluorescenza, permettendo di distinguere ampliconi con diversa sequenza, e quindi diversa temperatura di melting. Ciò consente di rilevare diverse varianti di sequenza del DNA come: cambiamenti di singola base, inserzioni, delezioni e duplicazioni. I protocolli analitici quali l'HRM sviluppati durante la RC LT 07/20 saranno ottimizzati, in collaborazione con la Fondazione Edmund Mach (FEM), con l’obiettivo di portare il protocollo di screening sviluppato per la rilevazione di linee editate di vite a discriminare le diverse linee editate in base al tipo di mutazione presente, ed al contempo di tentare l’applicazione del protocollo ad altre specie vegetali, tra le colture frutticole più coltivate nelle regioni temperate del mondo. La scelta sarà orientata tenendo conto dell’interesse dei consumatori e, dal punto di vista agronomico, delle nuove sfide poste dal cambiamento climatico che espone le colture tradizionali a nuovi stress biotici (insetti o agenti patogeni batterici, fungini e virali) ed abiotici (siccità, temperature, alterata composizione del terreno). Il progetto potrà selezionare le linee pilota, tra quelle trasformate presso la FEM mediante sistema CRISPR/Cas9, e sviluppare un metodo in PCR real-time con analisi HRM per la caratterizzazione delle linee editate prese in esame.